DNA 테크놀로지: 클로닝

1. 클로닝: 관심이 있는 DNA 절편을 백터에 넣어 세포에 도입한 후, 세포를 증식하여 충분한 양의 DNA를 얻는 과정 

---

a. 필요 개념

 

i) 제한효소: Restriction endonuclease: 

 

1. 세균이 바이러스 특히 박테리오파지로부터 자신을 방어하기 위해 생산하는 효소이자 방어 메커니즘이다. 
   1. 이중가닥 DNA의 특정 염기서열을 인식해서 인산다이에스테르 결합을 끊는 효소이다.  
   2. 메틸화 효소들아 N6-methyladenosine(N6-메틸 A)/N4-methylcytidine (N4-메틸C) 같은 변형염기들을 만들어 제한효소가 인식하지 못하게 하여 세균 자신의 염기가 절단되는것을 방지함. 
2. 회문 구조 서열 인식 (Palindromic sequence) 하여 절단 
   1. 무딘 말단 (Blunt end) 혹은 점착성 말단 (Sticky end)가 될수 있다. 
   2. Ligase: 5' 말단 인산이 제거 되면 서로 연결 반응이 일어날수 없다. 
   3. DNA 절편 농도 ↓ 자가 연결 비율 ↑
   4. DNA 절편 농도 ↑ 절편 간 연결 비율 ↑

 

ii) PCR: 시험관에서 특정 DNA 절편을 대량으로 증폭하는 실험법 

1. 문제점:
   1. 10 kbp 이상의 긴 DNA는 증폭이 어렵다. 
   2. 수선효소들이 없기에 시험관 복제시 에러확율이 높아진다. 

 

iii) 벡터: Vector: 관심 있는 DNA 절편을 세포에 도입하기 위해 필요한 운반체. 일반적으로 플라스미드를 변형하여 사용한다. 

1. 조건
   1. 복제원점: 세포내에서 복제하기 위해 필요
   2. 선택 마커: 배지에서 살아가는데 필요한 유전자 
   3. MSC (Multicloning site): 여러 제한효소들이 인식할 수 있는 염기서열들이 밀집된 부위 

---

b. 실험 과정 

 

1.  DNA에서 관심있는 서열만 PCR로 증폭하여 절편을 획득
2. 벡터에 제한효소를 처리해 MCS를 자르고 획득한 절편과 리가아제를 처리해 서로 연결시킴 
3. 만들어진 백터를 대장균에 형질전환 함 
4. 항생제가 처리된 고체 배지에 대장균을 뿌려 벡터를 지닌 대장균만 선별한다. 

 

 

c. 관련 실험 ( MEED 기출 주제)

 

 

1. Alkaline phosphatase 법 
   1. 벡터를 제한효소로 자른뒤 알칼리성 포스파테이즈 처리 --> 5' 인산 제거됨; Ligase에 의한 자가 연결 불가능 
   2. 잘린 벡터와 DNA 절편을 섞어 연결 반응 진행
   3. 절편이 삽입된 벡터를 대자균에 형질전환하면, 대장균의 수선 효소들이 5' 인산이 제거된 자리를 수선 효소들로 수선됨
2. pBluescript 벡터
   1.  MSC 가 LacZ (β-galactosidase) 유전자의 중간에 들어 있음 
   2. MCS를 제한효소로 자르고 DNA 절편과 섞음 --> 완성된 벡터를 대장균에 형질전환 
   3. 암피실린과 X-gal 을 첨가한 배지에 뿌려 키움
   4. 생성된 콜로니는 두가지 색으로 나뉜다. 
      1. 자가 연결 벡터: LaZ 유전자 발현하여 X-gal을 분해 = 파란색 
      2. 절편 삽입 벡터: Laz 유전자 파괴됨 X-gal 분해 X = 흰색
3. pBR322 벡터
   1. 1. 이 벡터는 암피실린과(Amp) 와 테트라사이클린(Tet)에 대한 항생제 내성 유전자가 있음 
         1. 참고
            1. 단백질 합성 억제제, tetreacyclin: https://31915.tistory.com/6?category=958866
            2. 세포벽 억제제, ampicillin: https://31915.tistory.com/3?category=958866
      2. Tet 저항성 유전자 내의 제한효소 자리를 자르고 DNA 절편과 섞어서 연결 반응함  
      3. 완성된 벡터를 대장균에 형질전환 --> 이후에 암피실린 첨가 배지에 뿌림 
      4. 암피실린 배지에 생긴 콜로니들을 복제판 배양법으로 테트라사이클린 첨가 배지로 옮긴다 
         1. 이 과정으로 자가 연결 벡터 or 절편이 성공적으로 삽입된 벡터를 구분한다. 
         2. 절편이 삽입된 벡터를 가진 대장균은 Tet 저항성 유전자가 삽입된 절편에의해 깨져버렸기 때문에 테트라사이클린 배지에서 살아남을 수 없을것이다.
         3. 아래 표에 빨간색의 조건을 충족한 콜로니를 얻음으로 절편이 삽입된 벡터를 지닌 대장균 확보가능하다. 

Amp 배지	Tet 배지
콜로니 형성	형성 X
콜로니 형성	콜로니 형성