벡터 (Vector) ★

저번 클로닝 포스트에서 가볍게 벡터라는 DNA 운반체에 대해 알아봤는데, 이번 포스트에서는 좀 더 다양한 종류의 벡터에 대해 요약해보고자 한다. 

 

벡터의 용량

 

   - 첫번째로 가장 많이 쓰이는 벡터의 종류인 플라스미드가 있다. 최대 10 kilobase 까지 운반이 가능하지만 좀 더 큰 용량의 DNA를 운반하기 위한 벡터들도 존재한다. 

벡터들을 크기순으로 표기 하면 플라스미드 < 코스미드 (Cosmid): ~50kb < BAC ~300kb < YAC ~1 Mb라고 가볍게 외워주면 좋을꺼 같다.

깊게 물어보거나 자주 출제 되는 내용들을 아니기에 각각 특징들을 여기서 자세히 설명하지는 않을 것 이다.  그리고 기본서에 워낙 잘 설명되어 있다...

 

발현 벡터 (Expression vector) 

 

• 기존 벡터의 조건에서; 복제원점, 선택 마커(selective marker), MCS, 추가로 프로모터 서열을 넣음으로 관심 DNA를 전사 번역함.  말 그대로 발현을 목적으로한 백터라고  생각하면  편할듯하다.
  • https://31915.tistory.com/10 : 클로닝 
• 특징 
  • 벡터를 두 가지 제한효소로 잘라 양 끝에 서로 다른 서열의 점착성 말단을 만듬
  • 관심 DNA를 PCR로 증폭시 프라이머의 5' 말단에 제한효소 인식 서열을 추가해서 --> 이후 증폭된 DNA도 두가지 제한효소로 자른다. 
    • 만일 무딘 말단이 생성되거나 한 가지 제한효소를 사용하게 된다면 DNA가 벡터의 어느 방향으로든 삽입 되거나 자가 연결 될 수 있기때문에 실험자가 원하는 방향으로 DNA를 전사, 번역이 어려워짐.
    • BUT! 벡터와 DNA 모두 점착성 말단 서열이 상보적으로 결합해야 하는 상황을 만듬으로써 올바른 방향의 DNA 전사, 번역이 가능하다. 이런식으로 DNA와 벡터 모두 두 가지 제한효소로 점착성 말단을 만들게 되면 연결 반응 할때 특이적 결합을 하게된다! 

두 개의 제한효소로 생긴 고유의 점착성 말단에 의해 정확히 상보적인 서열에만 결합을 할수 밖에 없는 상황이 만들어진다.

 

• 문제점 
  • 진핵생물의 염색체에서 얻은 DNA + 벡터가 형질전환된 대장균은 원핵생물이라 인트론 제거 불가능 --> 번역될수 없음
    • 해결법: RT-PCR로 진핵세포의 mRNA를 기반으로 cDNA (인트론 서열이 없음)를 얻음으로 대장균에서 번역될수 있게함 
  • cDNA를 사용하여 대장균에서 발현된다 하여도 번역 후 가공과정이 (이황화 결합, 당 첨가, 등등) 이루어 지지 않기에 일부 비정상적인 활성을 가진 단백질이 생김. 
    • 해결법: 
      • 이황화 결합: 산화제 처리 --> 인위적인 이황화 결합 생성
      • 당 결합: 당 결합이 필수적인 단백질들은 cDNA를 사용하기 보다는 다른 진핵생물에 (ex. 효모) 벡터를 넣어 발현시켜 정상적인 번역 후 가공 과정을 유도함. 
        • 인위적인 생성이 불가능함 
        • 이렇게 외래 DNA의 삽입으로 새로운 유전 형질을 얻게 된 동물을 형질전환 동물 (Transgenic animal) 이라고 한다.
•  조절 
  • 발현 벡터를 조절해야 하는 이유는...
    • 벡터에 삽입된 유전자에서 계속 대장균 성장에 불필요한 단백질 번역 --> 세균의 성장 속도 지연 --> 단백질을 충분히 얻지 못함.
    • 그럼으로 벡터에 삽입된 유전자가 원하는 시점에만 발현될 수 있게 조절을 해야함 
  • 방법
    • LacI + 작동자(Operator) 를 벡터에 넣어 평상시에는 발현을 억제시키다가 필요할때 IPTG를 넣어 발현을 유도함 
      • IPTG: 알로락토오스의 유사체이다. 차이점으로는 β-galactosidase에 의해 분해되지 않는다. 
      • Lac 오페론은 RNA Pol 활성화에 CAP이 필요하기에 18bp정도의 크기를 가진 T7의 프로모터를 삽입한다. 
    • 히스티딘-태그 발현 벡터: 발현된 단백질을 쉽게 정제하려는 목적을 가짐  
      • MSC의 5' 말단에 여러 개의 히스티딘 코드 서열을 삽입 --> 유전사 발현시 N 말단에 여러 개의 히스티딘이(태그)  붙은 채로 번역됨
      • 이후 분해효소로 태그를 제거하고 친화성 크로마토그래피로 목적 단백질만을 획득함.  

 

 

셔틀 벡터 (Shuttle Vector): 

 

• 발현 벡터와 다른점은 두가지의  각각 다른 종의 복제원점 과 선택마커를 사용한다는 것. (보통 대장균과 효모)
  • 이렇게 생성된 벡터는 당연히 서로 다른 두종에서 복제가 가능해진다!  
  • 대장균과 효모말고도 포유류에서도 셔틀 벡터는 사용가능한데. 유명한 예시로 아데노바이러스 셔틀벡터가 있다. 

 

• 과정: 대장균에 형질전환 --> 벡터를 복제함 --> Mini-Prep으로 벡터 회수 --> 효모에 다시 형질전환 --> 유전자 발현 시켜 원하는 산물 획득

 

• 셔틀 벡터의 가장 큰 이점은 비교적 간단하고 조작하기 쉬운 대장균을 통해 좀 더 복잡한 시스템을 가진 다른 종에 전파될수 있다는것.