DNA 테크놀로지 - 미니 프랩이란? Mini-Prep

미니 프렙(Mini-prep): 대장균이 증폭한 플라스미드들을 회수하는 실험법 

 

실험 과정

 

1. 원심분리해서 박테리아를 수확함 
2. 용액 I 와 리소자임을 첨가 후 현탁
   1. 용액 I: 50mM 포도당, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 
      1. 포도당: 세포 안팎의 삼투압 균형을 맞춰서 세포가 터져 DNA가 손상되는것을 방지 
      2. EDTA: 세포벽을 불안정하게 만듬; nuclease활성의 cofactor인 2가 이온을 제거 
   2. 용액 II 첨가 후 혼합
      1. 용액 II: 0.2 N NaOH, 1.0% SDS
         
         1. NaOH: 단백질, DNA를 변성
         2. SDS: 계면활성제로써 세포막을 파괴 
            1. SDS-PAGE에서 사용될때는 2개의 아미노산마다 음전하를 추가하는 역활. (꼭 구분할것) 
   3. 용액 III 첨가 후 혼합
      1. 용액 III: 3M 아세트산 칼륨 pH 4.8. 
         1. 아세트산 칼륨: 용액 중화 
            1. 박테리아 DNA = 외가닥에서 분리후 염기들끼리 소수성 결합하여 침전 
            2. 플라스미드 DNA = 다시 이중가닥 형성 가능; 상층액에서 발견가능
            3. KDS가 돼어 침전됨 (Potassium dodecyl sulfate)
   4. 원심분리 후 상층액 획득. 
   5. 이소프로판올(알콜)을 첨가한 후 혼합
   6. 원심분리 후 아래층을 얻음 
   7. 침전물을 70% 에탄올로 세척하여 염 제거
   8. 침전물을 적당한 부피의 Tris-EDTA buffer에 녹임 

공부할때 볼드체된 물질들의 역활을 확실히 암기하고 전체적인 실험의 맥락을 상상해볼것.